STM| |以毒攻毒:哈佛医学院董敏团队攻克了肉毒中毒难题
肉毒杆菌毒素是由革兰氏阳性菌肉毒梭菌及类似细菌产生的一种蛋白毒素。这个毒素家族有7个亚型(BoNT/A到bont/g) [1]。这种类毒素是自然界已知的毒性最强的毒素之一。在美国，肉毒杆菌毒素被列为六种最危险的受管制药物之一，也是一种潜在的生物恐怖剂(Arnon等人，2001年)。这种神经毒素专门针对宿主运动神经，阻断神经递质的传递，造成肌肉麻痹和弛缓性麻痹，导致患者不能活动，不能呼吸。7个亚型中，BoNT/A和BoNT/B引起肉毒中毒。由于肉毒杆菌毒素对运动神经元的特异性，A和B亚型也越来越多地用于治疗与神经过度兴奋引起的肌肉疾病相关的各种疾病。肉毒杆菌素是一种众所周知的消除美容皱纹的应用。
肉毒杆菌毒素家族蛋白是由单个基因编码的双链蛋白，合成后需要被蛋白酶激活，然后切割成两条链，包括轻链和重链。轻链由蛋白酶结构域组成，蛋白酶结构域是蛋白酶的一种，可以特异性切割神经元中负责囊泡-细胞膜融合的蛋白质，包括VAMP1、2和3、SNAP-25和突触融合蛋白1。正是因为轻链的这一特性，肉毒杆菌毒素才是阻断神经信号传递的最终执行者。重链包含两个结构域，N端的跨膜结构域和C端的受体结合结构域。在蛋白质结构层面，三个结构域相对独立，分工明确。受体结合域负责识别神经元上的特异性受体；跨膜域帮助轻链转移到细胞中；轻链切断细胞质中的底物，阻断神经递质的释放。
对于BoNT/A和BoNT/B引起的肉毒中毒的治疗，主要难点在于毒素进入神经元后其轻链在细胞质中半衰期极长，导致持续性神经阻滞和肌肉麻痹。这些症状可以持续几个月，临床上也没有药物可以抑制已经进入神经元的毒素。一旦中毒，患者需要重症监护和辅助呼吸设备来维持生命，生命可以持续数周至数月。由于周期长，治疗肉毒中毒会导致高额的医疗费用。而且一旦发生大规模疫情，很容易导致医疗设施不足。
开发治疗肉毒中毒药物的研究由来已久，但到目前为止，还没有小分子药物能有效抑制神经元内肉毒中毒的酶活性。抗体药物只能中和留在循环系统的毒素。2020年1月7日，哈佛医学院和波士顿儿童医院的董民's博士实验室在Science Translational Medicine,“Delivery of single-domain antibodies into neurons using a chimeric toxinbased platform is therapeutic in mouse models of botulism”发表了一篇题为《该研究用蛋白工程的方法开发了以融合毒素为平台将纳米抗体递送至神经元细胞内来治疗肉毒杆菌中毒，为快速有效的治愈肉毒杆菌中毒迎来了新的曙光。在线》的文章
在这项研究中，作者充分利用肉毒杆菌毒素极高的神经特异性，通过基因工程突变开发了解毒的肉毒杆菌毒素，并将其作为载体向神经元细胞递送纳米抗体，以中和A亚型和B亚型毒素。在此之前，其他实验室已经尝试使用灭活的肉毒杆菌毒素亚型，如BoNT/A和BoNT/C作为给药工具。虽然这些载体突变后在体外没有酶活性，但小鼠注射到小鼠体内后仍然表现出肉毒中毒和死亡的症状，其潜在机制尚不清楚。为了解决这个安全问题，董敏博士的实验室采取了不同的方法，试图改造一种新发现的肉毒杆菌毒素亚型Bont/X。这种毒素是董敏博士的实验室在2017年发现的一种新型肉毒杆菌毒素。它具有许多特殊的生化特性，包括更宽的底物裂解和更高效的膜结构域(张等，2017)。由于BoNT/X本身并不靶向运动神经元，作者仅利用X毒素的蛋白酶域和跨膜域作为药物跨膜转运工具，同时利用A、C、D型肉毒杆菌毒素亚型的受体域靶向运动神经元，从而产生人工嵌合的肉毒杆菌毒素(称为BoNT/XA、BoNT/XC、BoNT/XD)，通过突变X毒素酶的关键活性位点作为递送载体。
在将针对A亚型的纳米抗体(A8)与解毒的BoNT/XA、BoNT/XC和BoNT/XD(以下称为A8-ciBoNT/XA、A8-ciBoNT/XC和A8-ciBoNT/XD，见图1)融合后，作者首先在体外培养的神经元上进行测试，发现这些融合蛋白能有效抑制已进入神经元的A。然后，评估这些融合蛋白在小鼠中的毒性。当给小鼠注射100mg/kg A8-西邦/XA、A8-西邦/XC和A8-西邦/XD时，小鼠仍无任何中毒症状，从而解决了持久性残留毒性问题。
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图一：嵌合蛋白的构建和作用机理
作者然后以小鼠为模型及利用不同的给药方式对A8-ciBoNT/XA的药效进行了进一步的评估。在对小鼠的后肢进行局部注射BoNT/A后，该后肢会呈现出松弛性瘫痪症状，在没有药物干预的情况下，该症状会持续长达约40天至消失。在先注射BoNT/A后18小时，在相同的部位再次注射0.6微克的A8-ciBoNT/XA后，肉毒素造成的局部肌肉麻痹在几小时内开始缓解， 小鼠在2天内即可完全恢复正常。作者然后通过给小鼠腹部注射致死剂量的BoNT/A以诱发全身性的中毒症状，约9小时后小鼠即呈现出行动困难。在无药物干预的情况下，数小时后小鼠即表现出无法行动和呼吸困难。在注射BoNT/A后9小时，再通过腹部注射30微克A8-ciBoNT/XA，小鼠的中毒症状在6小时内消失并恢复正常的行动能力（见图二）。
图二：A8-ciBoNT/XA能有效的治愈BoNT/A引发的全身性肉毒杆菌中毒
最后作者采用一石二鸟的策略，将两个能分别中和BoNT/A与BoNT/B的纳米抗体（A8和J10）同时融合到消除毒性的BoNT/XA（蛋白称作A8-J0-ciBoNT/XA）。在小鼠模型中， A8-J0-ciBoNT/XA可以同时治愈由BoNT/A和BoNT/B引发的肉毒杆菌中毒。
该研究第一次建立了可以在肉毒素中毒症状出现以后的治疗方法。同时在临床上也可以用来快速消除由于不当使用肉毒素造成的肌肉麻痹，从而为肉毒素的安全使用提供了新的保障。这项研究也建立了一套有效的蛋白药物递送工具，可以把蛋白药物特异性的靶向神经元，并且高效的跨膜进入细胞内部。这一技术有潜力广泛的应用于递送蛋白药物到靶向细胞内部，从而可以突破目前的蛋白药物只能针对细胞表面靶点的局限性，让开发针对细胞内的药物靶点的蛋白药物成为可能。
董民博士的实验室在肉毒素领域深耕多年，在多个方面均有重要的发现，如肉毒素受体的鉴定及其识别机制和开发医用上更高效肉毒素。同时实验室还先后发现两个新的类肉毒素，本研究中所采用的BoNT/X就是其中之一，均具有较高药用价值。
https://stm.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/scitranslmed.aaz4197
参考文献
1. Dong, M., Masuyer, G., & Stenmark, P.(2019). Botulinum and tetanus neurotoxins. InAnnualReview of Biochemistry.https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-013118-111654
2. Arnon, S. S., Schechter, R., Inglesby, T. V.,Henderson, D. A., Bartlett, J. G., Ascher, M. S., Eitzen, E., Fine, A. D.,Hauer, J., Layton, M., Lillibridge, S., Osterholm, M. T., O’Toole, T., Parker,G., Perl, T. M., Russell, P. K., Swerdlow, D. L., & Tonat, K. (2001).Botulinum toxin as a biological weapon: Medical and public health management.Journalof the American Medical Association.https://doi.org/10.1001/jama.285.8.1059
3. Zhang, S., Masuyer, G., Zhang, J., Shen, Y.,Henriksson, L., Miyashita, S. I., Martínez-Carranza, M., Dong, M., &Stenmark, P. (2017). Identification and characterization of a novel botulinumneurotoxin.Nature Communications,8.https://doi.org/10.1038/ncomms14130